I molekylærbiologi kan godt buffervalg og forberedelse for forskjellige DNA-isolasjonstrinn være forskjellen mellom å gå videre til proteinuttrykk eller åpne et annet maksi-prep-sett for å starte over. Til tross for deres avgjørende betydning er bufferoppskrifter ofte bare det-oppskrifter skrevet uten forklaring eller begrunnelse for de forskjellige komponentene. En slik buffer er glukose-tris-EDTA eller GTE-buffer.
$config[code] not foundHva brukes GTE til?
GTE brukes til å resuspendere bakteriecellepellets før lysing (bryte åpning) av cellene og høsting av plasmid DNA inni. Lysozym, som myker cellemembranene, blir ofte tilsatt sammen med GTE-bufferen. Å oppnå en homogen suspensjon av hele celler under dette trinnet slik at den etterfølgende tilsatte lysoppløsningen kan komme til alle cellene er nøkkelen til å få gode DNA-utbytter. GTE er designet for å gjøre dette samtidig som det gir et stabilt miljø for DNA.
Glukose for osmolaritet
50mM (millimolar) glukosesukker blir tilsatt til GTE-buffer for å opprettholde osmolaritet hvor løsemiddelkonsentrasjonen utenfor cellene er nær det inne i cellene. Dette forhindrer for tidlig cellelys, noe som kan forårsake lavere DNA-utbytt på grunn av aggregering og nedbrytning. De andre komponentene i bufferen bidrar også til løsningen av osmolariteten, men glukose, som er en ikke-elektrolytt, er et godt valg fordi det ikke forstyrrer løsningens bufferegenskaper.
Tris for pH-stabilitet
Tris er kortnavnet for tris (hydroksymetyl) aminometan, som er en svært vanlig pH-buffer. I tilfelle av GTE-buffer blir syresaltet (Tris-HCl) tilsatt til bufferen ved en konsentrasjon på 25 mM. Dette opprettholder pH i oppløsningen ved en nær fysiologisk 8,0, en ideell pH for å forhindre sur hydrolyse (nedbrytning) av plasmid-DNA og uønskede sidereaksjoner av de andre cellekomponenter.
EDTA forhindrer DNA-nedbrytning
EDTA eller etylendiamintetraeddiksyre, fanger eller "chelater" metallioner ut av løsningen, slik at de ikke kan delta i uønskede sidereaksjoner. I GTE-buffer blir EDTA tilsatt ved 10 mM. Dens primære formål er i bufferen å rense opp gratis sink, magnesium og kalsium, og dermed forhindre DNA-nedbrytning ved visse veier som krever disse metaller.
Noen viktige tips
Hold GTE-bufferen kald og gjør den i små mengder for å hindre veksten av utilsiktede bakterier i den. Sukker og kontrollert pH gir et godt vekstmedium. Bruk alltid renset vann. Kranvann kan ha overflødig metallioner fra rørene, noe som kan overvelde EDTAs evne til å fange. Hvis du mistenker tilstedeværelsen av forstyrrende RNA i prøven, legger du til RNase A ved 100 mikrogram per milliliter til din GTE-buffer for å eliminere problemet.
